孔雀石綠ELISA試劑盒操作說明

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測測樣本中的孔雀石綠。（ MalachiteGreen oxalate ，MG)，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的孔雀石綠和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗孔雀石綠抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含孔雀石綠含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中孔雀石綠的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.025ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃， 30min～30min～15min

2.3 檢測下限：

魚/蝦…………………………0.1ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

 2.5 樣本回收率：

魚/蝦等水產(chǎn)品、水樣……………85%±15%

3 試劑盒組成                                                                                                                

酶標(biāo)板………………………………96孔

高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液1瓶（1ml/瓶）：10ppb（高標(biāo)準(zhǔn)液有揮發(fā)性，需注意密封）

標(biāo)準(zhǔn)品溶液0ppb、0.025ppb、0.05ppb、0.1ppb、0.2ppb、0.4ppb（均為空瓶子，現(xiàn)配現(xiàn)用）。

酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………11ml

抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

助溶劑（黃蓋）………………………6ml

氧化劑（黑蓋）………………………6ml

10X復(fù)溶液（黃蓋）…………………20ml

20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

說明書………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：乙腈（色譜純）、乙酸乙酯、甲醇

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：1×樣品復(fù)溶液

以100 ml為例，取10 ml 10×復(fù)溶液加入50ml去離子水和40ml甲醇，充分混勻。

配液2：1×工作洗滌液

將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 魚、蝦

1）取勻質(zhì)無骨的樣品1 g，加入50 ml離心管中，加入0.3 ml 乙腈、6 ml乙酸乙酯，充分震蕩（不少于5分鐘，確保魚肉沒有結(jié)塊）；

2）室溫下4000r/min 離心10min，取上清液3 ml加入10ml玻璃試管中，再加入氧化劑50 ul，震蕩2分鐘；

3）每管加入助溶劑50 ul(不振蕩)，50℃水浴環(huán)境下氮?dú)獯蹈桑ù低曛蠊艿撞繎?yīng)該有一滴液狀物，當(dāng)樣本含油脂過高時(shí)，此時(shí)可見試管底部殘留有黃色粘稠狀液滴）；

4）加入1 ml 1×樣品復(fù)溶液，溶解混勻，取50ul用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：2     檢測下限：0.1ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實(shí)驗(yàn)開始前需配制標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液；低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定，需現(xiàn)配現(xiàn)用（配好的標(biāo)品在4℃可穩(wěn)定1個(gè)月）。

在0ppb的瓶中加1×樣品復(fù)溶液3ml，0.025ppb、0.05ppb、0.1ppb、0.2ppb的瓶中分別加1×樣品復(fù)溶液1.5ml，0.4ppb的瓶中加1×樣品復(fù)溶液2.88ml。

標(biāo)準(zhǔn)液6：取10ppb高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液120ul加入裝有2.88ml 1×樣品復(fù)溶液的0.4ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.4ppb。

標(biāo)準(zhǔn)液5：取1.5ml標(biāo)準(zhǔn)液6加入裝有1.5ml 1×樣品復(fù)溶液的0.2ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.2ppb。

標(biāo)準(zhǔn)液4：取1.5ml標(biāo)準(zhǔn)液5加入裝有1.5ml 1×樣品復(fù)溶液0.1ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.1ppb。

標(biāo)準(zhǔn)液3：取1.5ml標(biāo)準(zhǔn)液4加入裝有1.5ml 1×樣品復(fù)溶液的0.05ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.05ppb。

標(biāo)準(zhǔn)液2：取1.5ml標(biāo)準(zhǔn)液3加入裝有1.5ml 1×樣品復(fù)溶液的0.025ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.025ppb。

標(biāo)準(zhǔn)液1：直接使用1×樣品復(fù)溶液，濃度即為0ppb。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔，25℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間）。

6.7 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.8 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以di一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。