【產品名稱】羊痘病毒PCR試劑盒
【包裝規(guī)格】 50T/盒
【產品方法】實時熒光PCR法
【預期用途】
適用于羊痘病毒檢測，可用于臨床羊痘病毒感染的輔助診斷，但不作確診使用。
【羊痘病毒PCR試劑盒檢驗原理】
羊痘病毒檢測試劑盒針對羊痘病毒的高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含羊痘病毒基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現檢測結果的定性分析。
【主要組成成份】
RT-PCR反應液、混合酶液、陽性對照、陰性對照。
【儲存條件及有效期】
避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期為12個月。
【適用儀器】
ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【檢驗方法】
試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數
單反液配制表(每份) | PCR反應液（UNG酶及Taq酶） | 20 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
（4）蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管轉移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司DNA提qu試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。
PCR（PCR擴增區(qū)）
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集LSDV熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數 |
UNG處理 | 37℃：2分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
58℃：40秒（s） （此階段結束時采集熒光信號） |
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。
2.標本結果判定：
（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期。
（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗方法的局限性】
當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結果。
本試劑盒僅供標本初步篩查使用，對于本試劑盒檢測陽性結果應進一步使用培養(yǎng)法進行確診。
【注意事項】
使用本試劑盒的實驗室，應嚴格按照國家有關部分頒布的有關基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；
為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理；
各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結束后，應立即對工作臺清潔；
吸取反應液時，應盡量避免產生氣泡；上 PCR 儀前，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結果不準確；
試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心；
試劑盒內所配陰性和陽性對照在次使用前應全部轉移至標本準備區(qū)，并單獨存放；
為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記；
檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內，檢測結束的PCR 反應管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同后丟棄；工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒；
9.儀器擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內使用。
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