描述：出血性大腸桿菌O157:H7(EHECO157)PCR試劑盒是上海臻科生物科技有限公司的產(chǎn)品,靈敏度好,準(zhǔn)確性高,現(xiàn)貨供應(yīng),歡迎廣大新老客戶前來(lái)選購(gòu)。
【產(chǎn)品名稱】出血性大腸桿菌O157:H7(EHECO157)PCR試劑盒
【包裝規(guī)格】 50T/盒
【產(chǎn)品方法】實(shí)時(shí)熒光PCR法
【預(yù)期用途】
適用于檢測(cè)，可用于臨床出血性大腸桿菌O157:H7(EHECO157)感染的輔助診斷，但不作確診使用。
出血性大腸桿菌O157:H7(EHECO157)PCR試劑盒【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒采用TaqMan 探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計(jì)一對(duì)出血性大腸桿菌O157:H7(EHECO157)特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，利用相應(yīng)儀器對(duì)PCR 過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原 學(xué)診斷。
【主要組成成份】
反應(yīng)液、酶液、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次，有效期 12 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
【保存和運(yùn)輸】上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
血液、體液和棉拭子樣本取100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2 核酸提取
推薦采用核酸提qu或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提qu，請(qǐng)按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。
2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；反應(yīng)管 數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 | RP反應(yīng)液 | 酶液 |
用量（樣本數(shù)為N） | 20μL | 1μL |
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1 提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短 暫離心。
4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL； 熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時(shí)間 | 收集熒光信號(hào) |
1 | 1cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
2.結(jié)果分析判定
2.1 結(jié)果分析條件設(shè)定設(shè)置Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像 調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)）、stop 值（一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)），以及 Threshold 的 Value 值（上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照），重新分析結(jié)果。
2.2 結(jié)果判斷陽(yáng)性：檢測(cè)通道Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線； 可疑：檢測(cè)通道 35值≤38，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為 35值≤38，且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線， 判定為陽(yáng)性，否則為陰性； 陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值。
3.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無(wú) Ct 值顯示； 陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
4.檢測(cè)方法的局限性
1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
2.樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；
3.陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；
4.病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
6.試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；
7.本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
【注意事項(xiàng)】
1.所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完quan混勻并短暫離心；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
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